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Descubierta por Ponce de León, Pinzón, Díaz de Solís y Vespuccio cuando navegaban en torno al golfo de México. A comienzos del S. XVI, varias disposiciones que autorizaban llevar a indios de aquellos lugares donde no hubiese oro, permiten suponer que llegaron a Florida((antes conocida con el nombre de Binimi)) varios viajeros más, desconocidos, hasta que en la primera década de abril de 1513, Ponce de León tomó posesión de aquella supuesta isla dándole la denominación actual, bien por la belleza de su tierra o por la festividad de la Pascua Florida. Con estas noticias , el Papa León X erige el 5 diciembre 1520 la diócesis de Santiago de la Florida, cuando en realidad no había en ella un solo cristiano; además, las expediciones depredadoras organizadas aquel año por Diego Caballero, Vázquez de Ayllón y Ortiz de Matienzos para coger esclavos, llevadas a la práctica por Gordillo y Quexos, eran una mala preparación para el establecimiento de la Iglesia en aquel lugar. A ello es debido que fuese rechazada la segunda expedición de Ponce de León, realizada en 1521, y que, de las heridas recibidas, éste muriera poco después.
Buscando el estrecho de Anián recorrió Esteban Muñoz en 1525 las costas desde Terranova a Florida. El mismo año Lucas Vázquez de Ayllón envió a Quexos con dos naves y luego, en junio de 1526, salió él mismo, alcanzando el cabo Fear y muriendo en octubre aquel año. La exploración de las tierras continentales comenzó con la desgraciada expedición de Narváez que en abril de 1528 desembarcó en las inmediaciones de Tampa. Álvar Núñez Cabeza de Vaca y cuatro supervivientes más cruzaron Norteamérica de este a oeste en un largo viaje de ocho años. En 1538 salió de España la expedición capitaneada por Hernando de Soto, que realizó una parecida epopeya descubridora, partiendo también de Tampa.
En 1544 Julián de Sámano, hermano del secretario de Carlos V, y Pedro de Ahumada, hermano de Santa Teresa, pretendieron conquistar Florida, pero el rey no dio la autorización por escrúpulos de conciencia. Sin embargo, poco después la concedía a fray Luis de Cáncer, compañero de Las Casas, para que la llevase a cabo con la sola predicación del Evangelio sin la intervención de las armas, pero antes de poder hacerlo, Cáncer pereció, al desembarcar en 1549. Tras este fracaso, Pedro de Santander propuso la colonización con gente remunerada para no abandonar a los indios, asegurar el paso de las flotas y evitar el asentamiento de enemigos. En 1558, Guido de Lavezares se estableció en la bahía filipina (Mobile) y en 14 de agosto de 1559 fondeó en Pensacola la expedición de Tristán de Luna, entre cuyos misioneros iba el gran defensor de los indios, Domingo de Salazar, luego obispo de Manila. Recorrido el territorio, no pudieron establecerse en él y fueron recogidos en 1561 por Ángel Villafañe, que intentó poblar en Santa Elena (Carolina del Sur) sin conseguirlo.
La conquista definitiva se efectuó al fundar los hugonotes una colonia en la costa atlántica en 1562, la cual, abandonada poco después, se restauró por orden del almirante Coligny, aun teniendo noticias la reina de Francia por su hija, Isabel de Valois, que el esposo de ésta, Felipe II de España, no consentiría la presencia de herejes en sus territorios. Se pretendía con ello atacar la flota de Indias al cruzar el canal de las Bahamas; trasladar las guerras de religión al Nuevo Mundo y enfrentar la opinión francesa contra España. Menéndez de Avilés se encargó de eliminar estos problemas y lo hizo cumpliendo las durísimas órdenes que recibió del monarca. Tras la victoria, desplegó gran actividad y aseguró la colonización española; estableció fuertes en la bahía de Carlos, Tampa, Gualé y Santa Elena, asegurando su comunicación por mar; e hizo amistad con los caciques vecinos, a los que intentaron cristianizar los primeros jesuitas llegados al Nuevo Mundo a petición suya. Uno de ellos, el P. Martínez, fue sacrificado por los indígenas. Fracasada la evangelización en el sur de la península, los jesuitas se establecieron en 1570, totalmente solos, en la región de Ajacan (Virginia), donde fueron martirizados, librándose únicamente un niño de doctrina. En 1572 la Compañía de Jesús abandonó Florida, siendo sustituida por la Orden de San Francisco. La primera década franciscana fue una época turbulenta en la que se abandonaron los puestos misionales, aunque se volvieron a ocupar más tarde logrando su definitivo afincamiento.